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豬源益生芽孢桿菌的分離篩選與應用研究

時間:2018-07-15 08:51:53  來源:  作者:

  因抗生素濫用而導致的毒性殘留、耐藥性等問題已引起人們的廣泛關注。尋找安全、無毒的替代品迫在眉睫。長期的生產實踐及大量研究表明,多種芽孢桿菌對動物正常生理狀態的維持和生長繁殖都有重要意義。芽孢桿菌不僅有抑制常見病原菌生長的能力,還能產生多種營養物質,是益生菌菌種開發的重要來源。 本研究依據益生菌篩選的常規方法和芽孢桿菌的判定標準,分離得到一株具有優良益生特性的地衣芽孢桿菌B36,研究了其體外益生性能、應用特點和優化了發酵生產工藝,斷奶仔豬飼喂實驗驗證了其防病促長效果。具體研究結果如下: 1、從健康育肥豬糞便中分離到160株芽孢桿菌,其中菌株B36對家畜養殖業中常見的腸道病原微生物如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O139和腸炎沙門氏菌具有有明顯的拮抗能力。經過生理生化實驗和16S rDNA序列分析鑒定為地衣芽孢桿菌,進一步研究表明該菌株具有較強的耐受人工胃液、人工腸液和耐膽汁的能力,能夠在動物腸道中發揮作用。該菌株芽孢具有一定的耐熱性,處理溫度低于80℃時,芽孢存活率保持100%,但100℃處理15 min后,存活率為5.5%。 菌株B36對常用的多種抗生素要具有很高的敏感性,在供試的24種抗生素中,只有多粘菌素B和桿菌肽對B36的抑制效果較弱,表明菌株不含有耐藥性質粒,不會在動物腸道中的微生物之間造成抗生素抗性的水平轉移。 2、通過對菌株抗菌物質的純化和理化性質分析發現,地衣芽孢桿菌B36產生小分子的蛋白質類細菌素,表現出廣譜抗菌作用,對革蘭氏陽性細菌都表現出強烈的抗菌活性,對部分革蘭氏陰性細菌也表現出抗菌能力,而對酵母和霉菌等真核微生物沒有抑制。細菌素具有良好的熱穩定性和酸堿穩定性,100℃處理30 min對活性沒有影響,115℃處理30 min活性損失75%,121℃處理30 min活性全部喪失;在pH 4-10的范圍內活性沒有變化。經過有機溶劑處理后的細菌素活性沒有損失。細菌素對常見蛋白酶也有抗性,僅對蛋白酶K敏感,作用1 h后活性下降到25%。經過硫酸銨沉淀和葡聚糖凝膠Superdex~(TM)G-75層析純化,質譜分析結果顯示細菌素的分子量為1422 Da。 3、通過單因素實驗和正交設計得到地衣芽孢桿菌B36的固體發酵優化培養基為麩皮700 g,稻草粉300 g,添加葡萄糖40 g/kg,蛋白胨20 g/kg,酵母抽提物20 g/kg,KH_2PO_4 10 g/kg,生石灰5 g/kg,調節初始含水量65%,37℃靜置發酵48 h芽孢產量可以達到1.73×10~(11)CFU/g。 采用上述優化條件,一種簡單實用、新型的網袋式生物反應器(Φ120×800 mm)被用于地衣芽孢桿菌固體發酵中試生產,芽孢產量可達到1.2×10~(11)CFU/g,同淺盤式生物反應器相比節約培養空間,具有更高的生產效率。 4、應用Plackett-Burman實驗設計,對影響地衣芽孢桿菌B36液體發酵產生芽孢的諸多因子進行了評價,篩選出了影響發酵產抗菌肽的主要內在因素。在Plackea-Burman實驗的基礎上,通過響應曲面法對主要影響因子進行優化與評價,并能得到影響地衣芽孢桿菌B36發酵產芽孢的二次多項數學模型,并利用統計學方法對該模型進行了顯著性檢驗。通過對該模型進行求導和解逆矩陣可知,優化后的培養基配方為:玉米淀粉46.6 g/L,蛋白胨3.8 g/L,豆粕粉21.3 g/L,(NH_4)_2SO_4 1.9g/L和CaCO_3 2.4·g/L,相應的芽孢產量預測值為Y=8.9×10~9 CFU/mL。采用優化的培養基進行驗證試驗,地衣芽孢桿菌最終芽孢濃度可以達到9×10~9 CFU/mL,而50 L發酵罐放大試驗培養結束時的芽孢產量可以達到1.3×10~(10) CFU/mL。 5、試驗選擇21±3日齡長大二元雜交斷奶仔豬120頭,隨機分為5組,比較研究了不同添加水平的地衣芽孢桿菌制劑對斷奶仔豬生產性能的影響。結果表明,添加地衣芽孢桿菌制劑可以顯著增加斷奶仔豬的平均日增重,降低耗料增重比,同時能夠預防仔豬腹瀉、提高仔豬成活率和改善飼養環境。

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